Mesenchymal stem cells in the colorectal tumor microenvironment

Mesenchymal stem cells(MSCs)는 조혈기능이 없는 다분화능력이 있는 성인 줄기 세포이다. 이 세포들은 다양한 종양 타입들로 자연적으로 향하는 성향을 가지며 면역적 감시를 피할수 있는 능력이 있다. MSCs는 종양에 합쳐지고 그들의 구조에 통합되는 것으로 잠재적으로 carcinoma-associated fibroblasts로 알려져 있다. 다른 암들과 다르게 colorectal cancer cell과 MSCs 사이의 상호작용의 이해는 아직도 제한적이다. 직장암 primary tumor 환경에서의 염증 중요성과 기질의 역할을 고려하여 세포 population 사이의 상호관계 연구로 부터 가치가 있는 정보들을 모았다. EMT는 직장 암 과정에 중심적이며 MSCs 또한 이 과정에 연관되어 있다. 이 리뷰에서는 현재 직장암과 MSCs들의 상호관계의 지식을 내포하고 있다. 연구의 결과를 통한 세포 source, 숫자, 비율의 잠재적 영향과 더 정확하게 microenvironment의 역할을 연구하는 전략을 중점으로 하고 있다.직장암의 발전에서의 기본적 molecular processes의 이해를 통해 microenvironment의 상호작용은 일반적 질병을 위한 일반 치료 전략의 발전에 중심이 될 것이다.

2008년도, colorectal cancer는 사망 암 중 8%로 4번째이다. 죽음의 주된 원인은 간이나 폐 처럼 치료할 수 없는 기관으로의 전이의 발전이다. 예후는 대부분 진단 단계와 연관된다. 1단계 진단 시 5년간 살 확률이 93.2%지만 4단계인 경우 8.1%이다. 우리의 최후 목표인 치료 전략의 개발과 함께 초기 직장 종양의 제한적 지식을 넓히기 위한 필요성이 강조된다.
종양은 염증세포, 면역세포, 종양 혈관, ECM, 기질로 구성된 environment rich이다. carcinomas는 epitherlial cell로부터 유래된 반면 복잡한 microenvironment의 기질의 역할은 최근 몇년간 중요성이 대두되었다. 암세포의 유전자형과 표현형은 고유적으로 종양을 번창하게 하고, 생명선을 제공하는 환경과 연결되어 있다. 종양의 증식은 그러므로 기질 요소에 의존적이다. Mesker는 직장암의 epithelial-stromal ratio은 림프관 상태와 종양 단계에 독립적인 생존의 예측변수가 된다고 보고하였다. 이 결과로, 이 분야는 잠재적 타켓에 위한 치료적 개입이 나타난다.

MSC
biology and characterization
MSCs는 stromal cell의 특징적인 소집단으로 골수에서의 조혈능력이 없고, 다분화가 가능한 매우 적은 percentage(0.01%)를 이루는 세포이다. MSCs는 상처난 장소나 만성적 염증 부분에 활성적으로 recruit 된다.
랫과 사람에서 컬쳐된 MSCs는 정맥주사를 통해 랫모델에 이식되었고 뇌 손상 부위로 이동하는 것을 보였다. 다른 그룹에서는 컬처된 MSCs가 투입후 심근경색에서 MSCs의 활용됨을 보였다.  온전한 심근이나 떨어져 있는 조직이 아닌 MSCs는 우선적으로 유도되고 유지되는 것으로 관측되었다. MSCs는 상처난 곳으로 이동할 수 있는 능력을 가지고 또한 상당량이 생산되기 때문에 특히 척추외상 같은 regenerative medicine으로 잠재적 사용에 흥미가 있다.
MSCs는 결장 점막 재생에 참여하고 최근 동물 모델에서 실험적으로 유도된 대장염의 치료를 촉진시키는 것에 관련되어 있음을 보였다. MSCs의 특징은 지난 몇 년동안 빠르게 증가하고 잇는 생물학적/의료적 관심으로 인해 필수적으로 여겨진다. MSCs는 CD105, CD73, CD90 in >95% of culture CD14, CD34, CD19, HLA DR, CD45가 없는 세포형성 지지자 세포 이다. MSCs는 또한 osteoblasts, adipocytes, chondroblasts로 분화할 수 있는 능력을 소유하였다. 이 세 가지의 mesenchymal differentiation은 MSCs를 가장 뚜렷하게 식별할 수 있는 능력이다. MSCs는 척수에서 쉽게 추출할 수 있으며 skeletal muscle, umbilical cord, amniotic fluid, adipose tissue 같은 다른 여러조직으로 부터 구별할 수 있다.

MSCs in Colorectal cancer
MSCs는 결장암이나 다른 암의 종양 기질로 이동한다. 이 이동 경로는 손상된 세포나 면역 세포에 의해 분비되는 growth factors 에서 hemokines 까지의 다양한 시그날에 의해 의존적이다. 척추에서 종양까지의 MSCs의 recruitment 메카니즘은 조직 치료 과정에서 이주와 염증 활성 세포와 중요한 공통부분으로 보여진다. 다양한 factors에 대한 MSCs의 DOSE-DEPENDANT 반응은 다른 암에서 보여지는 반면, 특히 결장암으로 MSC 이주에서 요소의 역할에 관한 관계에서 약간의 증거는 존재한다. 이 factor에는 monocyte chemotactic protein-1(MCP-1/CCL), EGF를 포함한 강한 immunogenic 특성을 지닌 growth factor, RANTES(CCL5), CXCL8, CD44 같은 receptors가 포함된다. Chamberlain et al. 은 종양으로 MSC migration은 integrin과 adhesion molecules를 통해 조절된다고 하였다. Haddow 와 led Dvorak는 종양은 결코 치유되지 않는 상처로 묘사되었다. 기질의 구성성분은 암과 염증 사이 길게 연결 뒤에 메카니즘의 주요 증거로 우리에게 제공되는 염증 과정의 중요 특성이다. 궤양성 대장암 같은 만성적 염증 상태에 secondary로 발생할지 않할지 모르는 염증 세포는 중요한 carcinomas의 기질 구성요소이다.

Potential precursors for carcinoma-associated fibroblasts
MSCs의 특이적 특징은 종양의 치료적 타겟팅 개발을 위한 잠재적 vectors로 사용에 대한 급증하는 관심을 이끌었다. 허나 우리는 우선 우리의 암과 MSCs 사이의 상호관계의 제한적 지식을 넓혀야한다. protumorigenic activity 나 immune 억제를 통한 잠재적으로 해로운 MSCs의 영향에 관해 우려가 떠올랐다. 연구들은 유방, 직장 등 다양한 암에서 진행되었으며 모순되는 결과를 가져왔다. 이 리뷰에서는 직장암에 초점을 맞추었다.
MSCs는 잠재적 CAFs의 precursor로 가설을 세웠다. CAF는 성장을 위한 주변환경을 support하 종양 생성과정과 직장암의 침투 행동을 활성시키는 fibroblast activation protin(FAP) 발현에 주요한 역할을 한다. Shinagawa et al. 은 꼬리 정맥에 인젝션을 통해 MSCs의 morphology와 분포가 직장암 기질에서의 CAFs와 유사함을 발견하였다. MSCs는 기능상 직장암 종양 기질에서 발현된 α-SMA, PDGFR-β, desmin, FAP, FSP을 포함한다. Henrikkson et al.은 bivroblast activation 마커로써 FAP 발현을 이용한 직장암세포 invasion을 이끄는 암세포와 fibroblasts 사이의 communication의 증거를 확인하였다. 그들은 실험적 연구에서 직장암 migration과 invasion에서 활성된 fibroblast의 영향을 분석하였다. FAP의 발현 패턴은 benign 에서 malignant까지 세밀히 조사하였다. 흥미롭게도 FAP는 모든 직장암 샘플에서 발현되었지만, 모든 정상 colon, hyperplastic polyps, adenoma 샘플에서는 negative를 보였다. three-dimensional culture에서 활성된 fibroblast가 대장암의 침투와 이주는 증가하는 것으로 보여진다. FGF-1/FGFR-3 시그날링은 migration/invasion의 증가를 이끄는 것으로 보여진다.
FGFR inhibitor와 FGF1 neutralizing antibody의 추가를 통한 대장암의 migration 감소 실험은 더 연구가 필요하다.
요약하면 Shinagawa et al은 직장암 기질안의 MSCs가 CAFs와 유사하였고 Henrikkson et al은 in CAFs FAP의 발현 패턴이 있었다. 이를 통해 직장암 종양 미세환경에서의 MSCs의 잠재적 역할에 대한 증거를 제공할 수 있다.
Nakagawa et al은 전이한 대장암으로 부터 bibroblast cell culture를 이용하여 암 기질의 molecular 특징을 연구하고자 시도하였다. 샘플은 metastatic colorectal cancer를 가진 환자로 부터 liver tumor, tumor-associated normal liver, skin에서 분리하였다. oligochip arrars를 이용하여 CAFs의 발현 양상과 malignat process를 포함하지 않은 fibroblasts와 비교하였다. 그들은 CAF cultures를 증식을 증가시키는 condition을 알아냈다. 또한 전이성의 대장암 CAFs에서 COX-2와 TGFB2의 발현을 확인하였다. epithelium specific marker인 cytokeratin-19/20의 RT-PCR을 통해 epithelial cell의 부재도 확인하였다. vimentin 과 α-SMA가 확인되었다. MSCs는 기능적으로 직장암 종양 기질을 포함하고 α-SMA을 발현시켰다. 더 나아가 vimentin은 mesenchymal lineage cells의 마커로 MSCs는 positive하다. 그러므로, 적어도 CAFs의 세포 퍼센트지는 사실 MSCs가 될 수 있다. MSCs는 CAFs의 잠재적 precursors 라는 발견의 중요성 강조하고 암세포 서포트 미세환경를 fibroblast가 형성시킨다는 가설을 대장암 전이의 CAFs의 분자적 발현이 서포트한다

Impact on colorectal cancer development and progression 
최근까지, 종양 형성 증가에 대한 대장 muyofibroblasts와 다른 fibroblasts의 영향이 연구되었으나 직장 종양 스피어 형성 및 개시에서 MSCs의 효과에 관련된 증거가 없었다. 혼합된 MSCs는 지금 스피어 형태로 직장 종양 세포의 능력을 증가시킨다고 보고되었다. 비슷한 연구로 MSCs-derived conditioned medium은 종양 스피어 형성을 증가시키는 것으로 보여진다. 더 나아가 3D co-culturing system 사용으로 invasive phenotype을 유도하는 mesenchymal marker vimentin에 대한 fibroblasts positive를 보여 tumorigenesis에서 MSCs의 역할을 서포트하고 있다.
최근 연구는 직장암의 migration, invasion, proliferation 대두되었지만, MSCs의 영향은 아직 미비한 실정이다. 최근 질병의 성장과 전이에서 MSCs의 영향에 초점을 맞추고 있다. 최근 연구에서 척추에서 유래된 MSCs는 대장암의 성장과 전이를 증가시키는 것으로 제안한다. 유래된 MSCs는 plastic adherent하고, multilineage differentiation 능력과 적절한 세포 표면 antigens의 발현에 의해 확인되었다. 첫, MSCs는 사람 대장암의 동물 모델 사용으로 colorectal tumors의 장소로 이동한다는 것을 확인하였다. 8주 암컷 무흉선 쥐에게 1x10^6 KM12SM human colon cancer cells를맹장에 이식하였다. 21일에 그들은 체계적인 PKH26-labeled MSCs1x10^6 인젝션을 받았다. 7일 후 죽었으며 정상 조직에서 발견되지 않았던 labeled MSCs가 종양 기질에서 발견되었다. 이 연구는 정위 부분에 co-injection을 이용하여 종양 성장에 대한 MSCs의 효과를 실험하고자 진행되었다. 이것 때문에 쥐는 3그룹으로 나뉘었다. 1 그룹은 오직 KM12SM cell(human colon cancer cell)만, 2 그룹은 KM12SM+MSC(1:2), 3 그룹은 MSCs 만 인잭션하여 종양 무게, 간으로의 전이, 생존률에 대해 평가하였다. 그 결과 종양 무게가 가장 큰 것은 KM12SM+MSCs이었고 생존률이 가장 낮았으며 성장 및 간 전이가 증가한 것도 혼합 그룹이었다.

MSCs:CRC 세포 비율이 MSCs가 colorectal cancer stroma에서 pro- / anti tumorigenic 역할을 할 것인지 현재 논란을 해결하기 위한 결정요인이 될수 있다. 비록 종양 미세환경에서 종양세포에 대한 MSCs 비율이 정해지지 않았지만, MSCs는 척추에 유핵세포의 규모의 오직 0.01% 를 차지하는 것으로 알려져 있다. 이 지식을 토대로 MSCs:CRC가 2:1 비율의 가설이 생리학상으로 적절한가?

만일 MSCs가 정상 섬유아세포와 같은 수로 대체된다면 증가된 성장을 관측할 수 있을지에 대해 성립하는 것이 중요하다. 모든 세포에서 분비되는 요소가 이 효과를 야기시키는지 또는 MSC 관련 현상일까? 비율의 변화와 정상 섬유아세포 포함하는 다른 co-injection 실험에서 연구되었다. 그들은 면역결핍 마우스에 human colorectal cancer cell, MSCs, mixture of both cell로 실험하였으며 MSCs는 colorectal tumors의 형성을 촉진한다는 결론을 보였다. HT29 human corectal cancer cells은 척추에서 유래된 MSCs와 다양한 비율로 믹싱되어 실험되었다. HT29 만 injection한 경우 1x10^5(83% within 3weeks) 1x10^6(100% within 1 week), 1x10^4 no tumors after a 6 month). 흥미롭게도 1x10^4 HT29 + 9x10^4 MSCs(1:9)에서는 2~3weeks 안에 종양 생성되었다. 그러나, 이 효과는 WI38 정상 폐 섬유아세포와 기본 섬유아세포에 대해 명시하였다. 비록 이것이 MSC-specific 현상이 아니라고 제안하지만, 종양 개시 또는 스피어 형성을 증가시키는 MSC의 능력은 정상 또는 tumor colonic myofibroblasts보다 상당히 높다. 중요하게도 MSCs만으로 2 x 10^6까지 종양을 생성할 수 없었으며 낮은 MSC:CRC 비율에서도 종양을 생성할 수 없었다.