2011년 6월 Int.J.Radiat.Biol 에 실린 프랑스 논문으로 

펌매드에 삼중수소(tritium)라 치면 도무지 자료가 나오지 않던 자료를 찾았다.

 

방사성 동위원소인 삼중수소가 피의 구성성분인 백혈구, 적혈구, 혈소판 등을 만드는 시초인 조혈줄기세포의 능력에 변화를 준다는 제목의 이 논문을 분자생물학 발표를 위해 공부하고 자료찾고 해서 나에게 도움이 많이 된 것 같다.

 

 

우선 삼중수소란 양성자 1개와 중성자 2개, 전자 1개를 가지는 원소로 수소의 동위원소이다. 이때 방사성을 띄는 동위원소를 방사성동위원소라 한다. 삼중수소는 그림과 같은 베타선을 내보내며 그 에너지는 18.6 KeV이다. 반감기는 12.3 년이고 생물학적 반감기는 7~14 일 정도된다.

베타선은 아래와 같은 투과력이 그렇게 강하진 않아 피부를 침투할 수 있는 거리가 약 6ucm 정도이다. 즉, 외부피폭에는 문제가 거의 되지 않지만, 내부로 흡입하거나 섭취하였을 경우 체내에 영향을 미칠 수 있다. 삼중수소는 수소와 같은 역할을 하기 때문에 물(수증기)로 존재할 수 있다.

삼중수소는 인에 둘러 쌓여있을 경우 베타선이 인과 작용하여 빛을 발하게 되는데 이를 이용한 상품들이 형광봉이나 표시등 등이 있다. 또한 군사용으로 야간의 소총 가늠자와 나침반, 시계 등에 많이 사용되고 있다. 

이 논문에서 말한 것처럼 감마선에 의한 영향들은 많이 연구가 되어있으나 베타선(삼중수소)에 의한 연구는 거의 없다.

 

 이 저자들은 조혈줄기세포를 실험 대상으로 사용하였다. 포유류의 가장 특징적이고 가치가 있는 피를 만드는 줄기세포.

최근 줄기세포 관련해서 여러 뉴스거리들이 많던데...

아무튼, 나야 뭐 조혈줄기세포를 연구하지 않았지만 논문 내용을 보면 쥐 골수에서 FACS를 이용해 cKit(CD117)에 양성 Lin에 음성 Sca1(stem cell antigen1)에 양성인 세포를 잘 분류해서 최대한 조혈줄기세포를 모아 배양한단다.

lin은 아래 줄기세포 그림에서 최대한 왼쪽 밝은 노란 부분의 세포를 표현한다고 생각하면 된다.

  

 

이렇게 잘 모아 키운 세포에 삼중수소를 처리한다.

처리 방법은 이 논문에서는 두가지 방법이 있다. [H-3] Thymidine 과 HTO를 처리하였는데, 티미딘은 아데닌, 구아닌, 시토신 과 더불어 DNA의 구성요소 중 하나로 티미딘의 수소 중 하나를 방사성동위원소인 H-3로 바꾼 것이다.

 

여러 방면으로 사용되는데

세포가 자라서 분열을 하려면 DNA의 합성이 필수적이며 이 때 Thymidine이 필요하게 되는데 방사능을 띤 Thymidinine을 넣어주게 되면 세포성장을 하는 것들은 3H-thymidine을 많이 포함하게 되고 세포가 이러한 방사능동위원소를 얼마나 포함하느냐에 따라 그 세포의 성장여부를 판단할 수 있다.

물론 세포의 수가 늘어나는 것을 관찰하여 세포성장을 볼 수도 있겠지만 위 방법을 사용하면 세포분열 이전에 그 경향을 알 수 있기 때문에 더 효과적이란다. 또 동물실험과 같은 경우 세포성장이 빠른 부분을 찾아내는데도 쓰일 수 있으며, 물론 이 때는 3H-thymidine 대신 BrdU를 더 많이 사용되며 BrdU는 다음에 설명하겠다.

아무튼 [H-3]Thymidine을 조혈줄기세포에 dose별로 넣고 측정한 결과 1000 세포 당 dpm을 보면 점차 증가한 것을 확인할 수 있다. dpm은 disintegrations per minute 으로 방사능을 측정한 값이다.

1dps는 1Bq이 되며 Bq는 베크렐 이라는 사람으로, 퀴리 부인과 같이 공동 노벨상을 받았으며 최초의 X-선을 발견한 사람이다.

아무튼 figure B, C는 그렇다면 세포에 이 H-3 티미딘이 얼마나 들어갔는지 확인한 결과로 방사선이 나오는 원리를 이용하여 방출되는 세포 %와 수를 측정하였다. 역시 dose별로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 

즉, 세포에 H-3 를 많이 먹일 수록 많이 흡수된다는 것!

 

그 후, H-3에 의해 베타선이 방출될 것인데, 이것이 증식과 생존, 괴사 쪽과 연관성이 있을까?

증식/생존 영향을 보기 위해 농도별, 시간별 세포수를 확인하였다. 시간이 지날수록 Control 세포 수는 증가하지만 삼중수소를 처리한 경우 세포 수에 변화가 없다.  뿐만 아니라, Annexin V를 이용 apoptosis 측정 결과 농도별로 증가하는 것을 확인 할 수 있다.

 

DNA 손상이 올 경우 뉴클레오좀의 히스톤 단백질에 영향이 있다. 그 중 H2A의 중요 구성성분인 H2AX 에 phosphorylation이 일어나게 되고 이를 r-H2AX 라 한다. H2AX에 phosphorylation이 일어나면 DNA repair 관련 단백질들이 모이고 DNA 복제를 멈추는 요소들이 진행된다. confocal을 이용해 r-H2AX foci를 통해 %와 개수를 확인 할 수 있다.

즉, 농도에 따라 DNA 손상이 일어나는 것!! 

 

아래 그림은 DNA 손상에 따른 cell cycle의 arrest를 표현한 것으로 삼중수소 농도에 따라 세포들이 G2/M기에 정체가 증가되는 것을 보여주고 있다. r-H2AX의 실험을 확인하는 것이다.

 

조혈 줄기세포를 연구하는 사람들이 하는 일들로 분화되어 어떠한 세포로 가는지를 보여주고 있다.

이때 하는 실험이 Colony forming unit assay라 하며 사진과 같이 특이 성분을 함유한 배지에 세포를 넣어 분화되는 특정 세포군을 확인하는 것이다. 삼중수소 농도별에 따라 분화 쪽은 그렇게 큰차이가 없다. 즉, 분화에는 삼중수소의 영향을 받지 않는다. 

 

조혈줄기세포의 Short / Long term의 회복성을 보았는데,

쥐 모델을 이용하여 측정하며, 우선 donor의 골수에서 조혈줄기를 빼낸다. recipient에는 강력하게 방사선을 때려 고유의 조혈세포들을 모두 죽이도록 한 후 transplatation한다. 즉, donor의 조혈 세포들이 recipent에 들어가 작용하는 것이다. 이를 확인하기 위해 4달 동안 사육 후 여러 마커들을 통해 어떤 세포로 분화될 것인지 본 것이다. 2차 이식 실험의 경우는 총 8개월의 긴 시간이 필요로 한다.  

figure A, B는 primary transplatation 이고 C, D는 secondary transplatation한 것으로 1차에는 그렇게 큰 차이들이 없지만, 2차에서는 삼중수소를 처리한 경우 B cell로 분화될 세포들이 감소되었음을 확인할 수 있다. 

즉, 삼중수소는 조혈줄기세포의 장시간 이루워진 조혈줄기세포의 능력을 감소시키는 역할을 한다.

 

 

 

Posted by 가우너