Immunofluorescence staining

Immunofluorescence staining of confocal

 

특정 molecule에 대한 specific primary antibody와 fluorescence dye가 conjugate되어 있는 secondary antibody를 이용하여 세포내의 위치 (localization), 분포 (distribution), 양 (amounts) 등을 알고자 할 때 유용하다.

 

<미리 준비해야 할 시약>

 

1X PBS (washing용)

고정액 (fixative) : paraformaldehyde (3.5%) : 10 mL의 PBS에 0.35 g paraformaldehyde와 1N NaOH 60 uL를 첨가 후 65도에서 중탕으로 30분 동안 녹인 후  상온에서 식혀 사용한다. 주의사항 : Paraformaldehyde는 harzadous하므로 가루나 증기를 흡입하지 않도록 주의하고 1 N NaOH를 첨가해 pH를 조정해야 paraformaldehyde가 잘 녹는다. Prepare fresh! 사용 직전에 만들어 사용.

 

Triton X-100 (0.1 %) : Permeabilization 용. 50 ml 정도 미리 만들어 두면 편하다. 50 uL의 Triton X-100을 50 ml의 PBS에 녹임. Triton X-100은 점성이 강하므로 pipetting시 정확한 volume이 되도록 주의하고 stirring을 오래 하여 완전히 녹인 후 사용한다.

 

Coverslip 준비 : 지름 1.2 cm의 coverslip을 준비하고, acetone으로 5분씩 2번 흔들어 주면서 세척한 후 methanol로 5분씩 3번 흔들어 주변서 세척한다. 호일에 펴서 말린 후 적당량씩 호일에 싸서 autoclave해 둔다. 35 mm dish에 coverslip을 5개까지 깔 수 있으므로 5개씩 호일에 싸서 멸균해 두면 사용시 편하다.

 

< Procedure>

 

Sample 준비 :  coverslip을 dish 바닥에 필요한 만큼 깔아서 세포를 seeding 한다.

ex) 1x10^5 정도

Coverslip는 PBS로 2회 수세 또는 알코올 램프로 살균 처리해 준다.

 

Fixation : Freshly prepared 3.5 % paraformaldehyde로 10 분 동안 상온에서 고정시킨다.

→ 3.7% Formaldehyde, in PBS사용, 20 min at RT

(Coverslip이 잠기도록 충분한 양을 넣어 준다. 35 mm dish에 coverslip을 깔아서 실험 하는 경우 1 ml 정도 적당하다.)

 

PBS washing for 5 ~ 10min, gentle shaking.
repeat PBS washing for 3 times

 

Permeabilization : 0.1 % Triton X-100 을 1 ml 정도 (35 mm dish의 경우) 넣고 10 분 동안 상온에 둔다. 만일 세포막 또는 세포외 단백질을 염색하려고 하는 경우 이 단계를 생략할 수 있다.

 

PBS washing for 5 ~ 10min, gentle shaking.
repeat PBS washing for 3 times

이단계 이후의 세척시 coverslip 주변의 물기를 완전히 제거한다. 왜냐하면 coverslip 주변의 물기 때문에 이후 blocking이나 antibody incubation과정에서 solution이 퍼져 버릴 수 있기 때문이다. 또한 coverslip 주변을 완전히 마르게 하면 coverslip 가장자리가 말라 버리게 되고 이 경우 염색이 안 되므로 이 것 또한 주의해야 한다.

 

Blocking : Blocking sol.은 실험하는 목적에 따라 다르게 적용될 수 있다.

1 % BSA를 포함하는 PBS를 사용한다. 상온에서 20분간 incubation.

PBS washing for 5 ~ 10min, gentle shaking.
repeat PBS washing for 3 times

 

Primary antibody incubation : PBS에 적정 농도(1:1000)로 희석하여 1 ~ 2h 또는 O/N at 4℃ 로 반응 시키고 PBS로 3회 수세한다. 세척 할 때 PBS로 1 ml 상씩 사용 ( 35 mm dish의 경우).

PBS washing for 5 ~ 10min, gentle shaking.
repeat PBS washing for 3 times

 

Secondary antibody incubation (conjugated FITC) Fluorochrome-linked anti-rabbit or anti-mouse

이들 reagents는 빛에 민감하므로 주의. 특히 fluorescence light에 노출 될 경우 이들 reagents의 활성도가 점차 감소함.

Secondary Ab binding (1:100 diluted in blocking buffer) FITC(형광물질:붙어있는것)
1hr at RT

PBS washing for 5 ~ 10min, gentle shaking.
repeat PBS washing for 3 times

 

Nucleus staining (counter staining) with DAPI(sigma D-9542)
DAPI stock sol. : 1mg/ml in D.W
DAPI stock sol.을 PBS에 1:1000으로 희석
PBS washing for 5min,
repeat for 3 times

(actin filament를 볼 경우, TRITC-conjugated phalloid(염색약)을 1:1000 in PBS에 37℃ incubation for 30min PBS washing for 3 times)

Mounting : PBS로 3회 세척하고 90 % glycerol 또는 mounting sol. 이용하여 mounting

Slide glass에 mounting sol.을 한방울 정도 점적한 후 염색한 coverslip을 tweezer로 조심스럽게 들어올려 휴지에 세워 남아 있는 물기를 제거 하고 난 후 slide glass에 뒤집어서 (세포가 부착되어 있는 면이 밑으로 가도록) 한쪽 끝에서부터 덮는다. 기포가 들어 가지 않도록 주의한다. Coverslip 밖으로 넘쳐 나온 mounting sol.을 휴지로 흡수 시키고 coverslip이 움직이지 않도록 투명 메니큐어로 디스크 끝부분을 고정시켜 준 후 5 min 정도 말리고 난 후에 형광현미경으로 관찰한다.

 

 핵안(DAPI 염색)에서 rH2AX 단백질이 발현된다는 것을 확인 할 수 있다.