Proteomics

Biology/실험 2013.05.09 10:39

 

단백체학.pdf

 

원문 출처 : http://labmed.hallym.ac.kr/genome/Proteomics.htm


주어진 환경에서 유전체(genome)에 의하여 발현되는 단백질들을 단백체(proteome)라 하며, 이를 연
구하는 학문을 단백체학(proteomics)이라고 한다. 어원은 "the set of PROTEins coded by a
GenOME"에서 비롯되었다. 최근, Proteomics가 대두된 이유는 첫째, mRNA의 발현으로 단백질의 발
현을 예측할 수 없으며, 둘째, 단백질이 변형(methylation, phosphorylation 등등)된 것을 gene
sequence에서는 알 수 없으므로 proteome을 연구하게 된 것이다.
일반적으로 genome에 의해 mRNA로 전사가 되면 그 전사가 된 것을 리보솜안에서 단백질로 번역해
낸다. 하지만 genome의 정보는 전사 과정에서 intron이라고 하는 비정보 영역과 exon이라고 하는 정
보 영역을 선택적으로 취하게 되고 이것을 다시 번역과정에서 변형시켜서 최종적인 단백질로 되는 것
이다. 따라서 우리가 정확한 유전자의 배열을 안다고 해도 실재 세포내에서 기능을 담당하는 단백질과
는 차이가 난다는 것이다. 이러한 맹점이 genome project 연구에서 proteomics 연구로 진행된 배경이
될 수 있다.


이들 Proteome 분석은 다음과 같은 특성을 가지고 있다.
1) 정제 과정 없이 조직, 개체등 시료에 존재하는 모든 단백질을 펼쳐 분석할 수 있다.
2) 유전자의 발현 정도를 한 눈에 알 수 있다.
3) 유전자에 의한 현상과 유전자 외적요인(multigenic/epigenic)에 의한 현상을 쉽게 추적할 수 있다.
4) 정상조직과 질병 조직, 그리고 좋은 품종과 나쁜 품종간의 단백질 발현 차이를 알 수 있다.
그 예로 APAF의 Chiron Project를 들어보면, 동일한 암 환자의 경우에도 전이가 빨리 진행된 경우의
환자와 전이가 안된 환자의 세포주에서 얻은 chiron으로 219개의 protein spot을 분석하였다. 그 결과
205개의 spot은 이미 알려진 단백질 이었고, 14개의 새로운 protein spot을 찾아냈다. 이들 두 시료의
차이점은 125개의 다른 protein spot을 찾아 냈으며, 이들은 대부분이 phosphorylation 및
glycosylation 등의 post-translational modification에 의한 것으로 밝혀졌다. 그리고, 서로 다르게 발
현된 25개의 단백질을 알아냈고, metastasis와 관련된 2개의 단백질, cancer관련된 18개의 단백질등
을 알아낼 수 있었다. 또한 이들 새로운 단백질중 4개는 heat shock protein을 포함한
phosphoprotein임을 알아냈다. 이와 같이 proteome을 연구의 활용 분야는 크게 진단과 치료제 개발
그리고 동식물의 품종 개량 등이다.


표 1. Genome과 Proteome의 비교

 

 

 

 

Proteome Analysis의 전반적인 Work Flow는
1) Sample preparation
2) 2-D Electrophoresis
3) Staining
4) Image Acquisition
5) Image Analysis
6) Protein Excision
7) Protein Identification으로 각 단계별 자세한 설명은 다음과 같다

1. Sample preparation
Ready Prep Sequential Extraction kit: Sample Preparation시 가장 중요한 점은

① 얼마나 잘 녹는가?

② 적은 양의 단백질로 2-D spot을 잘 볼 수 있는가이다.

2. 2-D Electrophoresis
1-D : PROTEAN IEF Cell ( 7 cm & 17 cm), ReadyStrip IPG strips
2-D : PROTEAN II xi Cell, Multi-cell + IPG conversion kit
( = PROTEAN II XL wide format cell, PROTEAN II XL multi-cell)
Mini PROTEAN 3 Electrophoresis system
Reagents : PROTEAN II Ready Gel Precast gels for 2-D, Ready gels,

Polyacrylamide Gel Electrophoresis reagents
1) ReadyStrip IPG stripsB
- semi-dry상태(4% gel)로 반드시 hydration step을 거쳐야 한다.
- Hydration 방법 : Passive, Active
- Hydration시 필요한 buffer의 양 : 300 ul

 

 

2) 예 : PROTEAN IEF Cell
- Tray가 플라스틱으로 되어 있으며, 이는 hydrophobic하여 channel 사이의 cross contamination이
없다.
- Tray 종류 : rehydration/equilibration trays(passive rehydration, equilibration), Focusing
trays(active rehydration, focusing)
- Sample run시 mineral oil을 덮어주어 buffer의 증발을 막아 준다.
- Program을 프린트 하려면, VersaFluor fluorometer에 사용하는 thermal printer를 RS-232 port를
이용하여 연결한다.
- Sample 용량 : 7 - 30 ul

- Sample loading은 passive rehydration인 경우 rehydration후에, 그리고 active rehydration인 경우
rehydration시 실행한다.
- Programming Parameter : Rehydration time, focusing time, platform temperature, current limit
per strip, voltage, voltage ramping type for each step
- Voltage ramping profile : rapid, linear, slow
- 10개의 program 저장가능, program마다 9 step까지 가능
- Current : 0 - 3 mA
- Power : 3 Watts
- Components : Basic unit, focusing trays with lid (7, 17 cm), rehydration/equilibration trays
with lid, forceps (2), electrode wicks(1pk), mineral oil, cleaning brush

 

 

3) PROTEAN II Precast gels
- Size : 20 x 20 cm
- Gel % : 12%, 10-20%, 8-16%
- Thickness : 1.0 mm
- 2-D Prep Comb (single well)
- Shelf life : 2 - 3 months

3.Staining
1) In Gel Detection :
- Silver Staining : 0.5 -1.2 ng(detection limit)
: Silver Stain(mass spec.에 사용 불가), Silver Stain Plus Kit
- Bio-Safe commassie stain: 8-26 ng,
- SYPRO Orange Stain : 2 - 10 ng
2) In Blot Detection
- Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell, Sequi-Blot PVDF membrane

4. Image Acquisition
- GS-710 Calibrated Imaging Densitometer,
- Fluor-S MAX MultiImage System,
- Molecular Imager FX

5. Image Analysis
- PDQuest 2-D Software,
- Melanie II 2-D software

Protein Excision
: PROTEAN 2-D Spot Cutter 2-D spot cutter
1) 특징:
- 정확한 spot selection
- 정밀한 spot cutting
- 자동화된 excision
- 한꺼번에 많은 spot을 cutting : 20분 안에 96개의 spot을 cutting.
- 한 spot에서 10번까지 cutting하여 한 well에 모을 수 있다. (batch method)
- High pixel resolution : 1,280 x 960 pixels (0.01 mm까지 정확하게 이동)
- Cutting Area : 11.8 x 8.8 cm (mini gel, large gel 모두 가능)

- Gel Frame이 있어 spot cutting시 gel이 마르는 것을 방지.
2) Software : SpotOn S/W
- Point, Click, Cut
- High resolution zoom으로 인한 정확한 spot selection
- Spot number 자동으로 지정
- 각 Spot의 위치가 자동으로 기록
- Text file로 저장하여 spreadsheets혹은 database로 볼 수 있다.
- Post-cut image file을 이용해 결과에 대한 graphics로 사용할 수 있다.

 

 

 

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Posted by 가우너


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