His-tag 재조합 단백질 분리정제

□ His-tag 재조합 단백질 분리정제
 His-tag은 재조합 단백질 말단에 붙힌 여러 개의 histidine을 가리키며, histidine의 금속이온에 대한 선택적 결합능을 이용하면 재조합 단백질을 쉽게 분리정제 할 수 있다. Histidine은 이미다졸기를 가진 아미노산으로 주로 Ni2+ 나 Fe2+ 등의 2가 금속이온과 결합을 잘한다. His-tag은 재조합 단백질의 발현벡터를 만드는 단계에서부터 부착 여부를 고려해야 한다. 재조합 단백질 염기서열의 앞부분이나 뒷부분에 여러 개의 histidine이 발현되도록 하는데, 보통 발현시키는 histidine의 개수는 6개 이상이다. His-tag은 여러 종류의 숙주세포에서 쉽게 발현시킬 수 있고, 짧은 배열의 염기를 붙이는 것만으로도 발현시킬 수 있기 때문에 사용하기 쉽다.

 

His-tag 재조합 단백질은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용하여 쉽게 분리할 수 있다. Histag을 발현시킨 재조합 단백질이 포함되어 있는 단백질 시료를 Ni2+가 결합되어 있는 gel을 채운 컬럼에 통과시킨
다음 세척 완충액을 컬럼으로 흘려준다. 그러면 his-tag 재조합 단백질만이 Ni2+에 부착되고 나머지 단백질을 그대
로 column을 빠져나온다. Ni2+에 부착된 his-tag 재조합 단백질은 고농도의 histidine이나 이미다졸을 흘려주면 gel로 부터 분리 된다. His-tag 단백질이 Ni-gel에 부착되어 있는 정도를 모르는 경우가 많기 때문에 his-tag 단백질을 모으기 위해 흘려주는 이미다졸 용액은 일반적으로 50, 100, 200 mM 등으로 농도를 변화시키면서 목표 단백질의 분리 조건을 최적화한다.

 

(위 사진은 wiki에서 가져온 NTA)

 

□ 아마 모든 실험실에서 가장 많이 사용하는 단백질 정제 방법이 히스티딘 tag을 이용한 affinity 크로마토그래피일 것입니다. 이미 여러 회사에서 상용화된 수지(resin)을 팔고 있습니다. 물론 값은 엄청나게 비쌉니다. 그 중 가장 많이 사용하는 Qiagen의 Ni-NTA superflow수지는 500ml에 3800불이나 합니다.
NTA는Nitrilotriacetic acid의 약자로서 분자식이 C6H9NO6입니다. NTA는 대표적인 메탈 킬레이터인 EDTA와 비슷한 성질을 갖는데 자연에서 잘 분해가 안되는 EDTA에 비해 쉽게 분해되기 때문에 장점이 있습니다.
이 NTA는 다양한 금속이온을 킬레이팅 하기 때문에 거기에 Ni을 붙이고 지지체와 연결시킨 것이 Ni-NTA resin입니다. 아래 그림에서 보시는 바와 같이 Ni 이온은 히스티딘의 이미다졸링과 배위공유결합을 할 수 있습니다. 하지만 고농도 (약 300mM)의 free imidazole을 넣어주면 히스티딘이 유리되어 단백질이 떨어져 나오는 것입니다.

 

 

(위 그림은 www.nanoprobes.com 에서 가져왔습니다.)

 

아미노산의 하나인 히스티딘은 아래 그림에서 보듯이 side chain에 이미다졸 링을 가지고 있습니다. 그래서 Arginine, Lysine과 더불어 양전하를 띄는 염기성 아미노산입니다. 하지만 사이드 체인의 pKa 값이 6.0이기 때문에 실제로 pH6 이상에서는 양전하를 띄지 않고 중성입니다. 그래서 남은 전자를 Ni 이온과의 배위결합에 이용합니다.