□ Primer 제작시 고려사항
① DNA염기서열을 알고 있다면 단백질로 발현될 ORF(open reading prime)부분의 양 끝을 primer로 제작하면 된다.
증폭시킬 DNA의 길이는 3kb이하가 적당하며, 주로 실험에서는 1kb이하로 사용하는 것이 좋다. 10 kb까지도 증폭이
가능하나 길어질수록 증폭효율이 감소하고 돌연변이 출현 확률이 높다. 만약 아미노산 서열을 알고 DNA염기서열
을 명확히 알지 못하는 경우가 있다. 이런 경우에도 primer를 제작할 수 있는데, 아미노산에 대응하는 코돈을 추정하
면 된다. 이때 다양한 codon usage를 가지는 Leu, Arg, Ser(6개의 codon usage)보다는 1개 또는 소수의 codon usage를
가지는 Met, Trp으로부터 유추하여 보다 적은 경우의 수의 primer들을 모두 제작하여 primer mixture를 사용하면 된
다.
② Primer의 길이는 일반적으로 18 ˜ 30 mer 정도가 적당하다. Primer 길이가 너무 짧으면 template DNA에 비특이적
으로 결합하게 되고, primer 길이가 길어지면 결합하는 속도가 느려지므로 30 mer이상의 primer는 거의 사용하지 않
는다. 18 mer의 primer를 사용한다고 가정했을 때 이론적으로 생각할 수 있는 염기서열의 종류는 418 =
68,719,476,736 가지이다. 인간 유전체의 3,000,000 kbp와 비교해서 상당히 큰 차이를 보이므로 20mer이상의
primer를 사용하면 인간 DNA의 한 부위에서만 결합한다고 생각할 수 있다.
③ G+C content가 50 ˜ 60%로 구성되도록 하여 4종류의 염기가 거의 같은 비율로 되도록 구성한다. 또한 동일한 염
기가 반복서열을 갖지 않도록 해야 한다.
④ 3'-말단에는 G나 C가 3개 이상 나열되지 않도록 해야 한다. G/C 함량이 높은 영역에서는 비특이적인 증폭을 야기
하여 DNA가 잘못 합성되는 경우가 발생하기 때문이다. 그리고 어떤 경우에도 3'-말단에 T가 오면 안 된다. T는 자신
과 상보적인 nucleotide를 감별하는 능력이 다른 염기에 비해 부족하기 때문이다. Primer 제작 시 5'-말단보다는 3'-말
단이 PCR product를 합성해 가는데 있어 중요한 부위이므로 더 신중하게 디자인해야 한다.
⑤ Primer 분자 내에서 자체적으로 hair pin loop 형성 등 2차 구조를 이루지 못하도록 해야 한다. 2차 구조를 형성하
게 되면 PCR에는 치명적인 영향을 끼치게 된다.
⑥ Tm 값이 동일하도록 두 primer를 제작해야 한다. Tm 값에 대해서는 아래에 자세히 설명하도록 한다.
위와 같은 점들을 고려하여 가장 적합한 primer를 제작하게 되는데, BioEdit 등의 컴퓨터 프로그램을 이용하여
PCR용 primer를 설계한다.

 

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Posted by 가우너