Western blot 중 SDS-PAGE gel

 

생물을 전공하면서 세포에 대한 네트워크 시그날을 보기 위한 필수적인 실험으로  단백질 발현양을 볼 수 있다.

 

우선적으로 separating gel을 %별로 정리해 보았다.
Separating gel (10 ml 정도면 gel 2장은 만들 수 있다.)

실험방 실험대에 부착되어 있는 것을 많이 보았을 것이다.

 

 

 

15% : 4~100kDa

12% : 14~150kDa

10% : 20~200kDa

8% : 40~250kDa

6% : 100~300kDa

 

보고자 하는 protein의 size가 얼마인지 미리 알아야 하는 것은 기본 중에 기본이다.
size에 따라 SDS의 농도를 달리하여 작은 size일 경우 %를 높이고
큰 size일 경우 %를 낮추어 보고자 하는 protein이 되도록 gel의 중간에 오게 조절해야 한다.

 

참고로 각 시약들 및 버퍼 만드는 방법을 퍼왔다.

Dr.Jin's lab - http://50jinjin.blog.me/150104095766

1. Acrylamide stock solution (pre-gel) (29% Acrylamide + 1% Bis-acrylamide = W/V)
Total volumn을 200 ml로 할 경우
Acrylamide 58.4 g
Bis-Acrylamide 6 g
먼저 DW 100 ml 에 녹인다. 의외로 시약이 많다. 넣어 보면 많다는 걸 안다.
절대 150ml이상의 DW에 녹이지 않는다… 만들고 나면 넘을 수도 있다… 조심..
시약이 다 녹으면 200 ml을 맞추고 4C에 보관

2. 10% SDS solution
Total 200 ml을 만들 경우
SDS 20 g
DW 150 ml 정도에 넣고 녹인다. 실내 온도가 낮을 경우 잘 안 녹는다.
Heating을 조금 해주는 것도 좋다. 다 녹으면 200 ml을 맞춰준다. 실온에 보관한다.
겨울철에는 침전이 생길 수도 있다. 그럼 조금 따듯한 곳에 두면 다시 녹는다.
흡입하지 않게 마스크를 꼭 착용하길 바란다.


3. 10% APS solution
많이 만들지 않는다. 사용되는 기간을 보고 만든다. 보통 일주일이 넘지 않게 사용한다.
10%로 만들면 되니까.
APS 0.1 g을 DW 1로 녹이고 갈색병에 담아서 4C에 보관한다.


4. 1.5M Tris buffer (pH 8.8)
그냥 M 농도로 만들면 된다. 다들 M 농도 계산 할 줄 알꺼라고 생각한다.
500 ml정도 만들어서 4C에 보관하면 된다…
알았다 그럼 간단하게 계산 해보자.
Tris MW : 121.14 이다.
121.14g이 1L에 녹아 있으면 1M이다.
그럼 1.5M이 될라면….
181.71이 1L에 녹으면 1.5M이 된다.
하지만 나는 1L를 만드는 것이 아니라 500 ml을 만들고 싶다.
그럼 2로 나누면 된다.
그러니까.
90.855 g / 500 ml = 1.5 M 이 된다.
이렇게 녹이면 되는데 중요한건 Ph가 허벌 안내려간다.
Tris는 Trizma base이다. 다시 말해 base가 이미 들어가있다는 말이다.
그래서 Hcl로 Ph를 조절하려 해도 잘 안내려 간다… 장갑끼고 마스크끼고
허벌 넣어 주길 바란다.

 

5. 1.2 M Tris (Ph 6.8)
같은 방법으로 만들면 된다. 이때는 Tris말고 Tris-Hcl을 사용하길 추천한다.

그리고 분자량이 다르니 잘 확인해 보고 사용하길 권한다.


6. TEMED
이건 돈주고 사는 거다. 시그마나 promega, biored등 여러 회사에서 판다. 얼마안한다.
그럼 이제 gel을 만들어 보자… gel은 두종류로 만든다. 틀을 잘 정비하고… gel이 세지 않
게 그리고 protein이 size 별로 분리되며 내려 갈수 있게 해주는 separating gel을 먼저 만
들고 잘 말린다음 그 위에 stacking gel을 만든다. Stacking gel에는 comb을 꼽아서
sample을 loading할 수 있는 자리는 만들어 주는 것이다.

 

순서는 크게 상관없으나 마지막 두 시약, APS, TEMED는 가장 나중에 넣는다. 이유는
이것들을 넣으면 반응이 시작되기 때문이다. 이 반응이 발열반응이라서 실내온도에 영향을
받는다. 여름에 기온이 높을 때는 비교적 빨리 굳어 버린다. 그럴 경우 TEMED의 양을 1~2
ul정도 줄여도 좋다. 반대로 겨울에는 1~2 ul정도 올려도 된다.
Gel을 틀에 넣을 때는 comb가 꼽힐고 2~3 mm정도 남을 정도로 부어준다. 정확한 높이를
가늠하기 어려울때는 마커로 미리 유리판 앞에 선을 그어 두는 것도 좋다.
Gel을 다 부었으면 gel 위로 100% ETOH or isoprophanol 같은 휘발성 시약을 분무기로
뿌려준다. 이때 절대 직접 gel 위에 정면으로 뿌리면 안 된다. 그냥 gel 위에 자연스럽게 뿌
려 수분이 gel 위에 천천히 내려앉게 한다… 그냥 막 뿌리면 된다…^^
Separating gel이 다 마르면 위에 남은 수분을 제거해준다. Filter 종이나 아니면 거꾸로 뒤
집어서 빼줘도 된다.


Separating gel이 거의 다 마르면 stacking gel을 만든다.
Stacking gel (2 ml 기준 - gel 한장)
DW 1.4 ml
Pre-gel 0.33 ml
1.2 M tris (pH 6.8) 0.25 ml
10% SDS solution 20 ul
APS solution 20 ul
TEMED 20 ul
잘 섞어서 separating gel 위에 넣는다. 바로 comb를 곱아준다. 그리고 궂이면
SDS gel 완성

잘 해서 좋은 데이터를 얻기 바란다.

 

Posted by 가우너

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