Gelatin- zymography (for MMP Analysis)

1. SDS-PAGE containing 1mg/ml gelatin (100mg/ml)

1) gel caster를 깨끗이 washing

2) 10% gel, 10ml 준비 (8ml:2개-5ml:1개)개의경우

조성: - H2O 4 ml(3.2 - 2ml)

- 30% acrylamide mix 3.3ml(2.64-1.65ml)

- 1.5M Tris (pH 8.8) 2.5ml(2 -1.24ml)

- 10% SDS 0.1ml(0.08 -0.05ml)

- 10% ammonium persulfate 0.1ml(0.08 -0.05ml)

- gelatin 0.1ml(0.08 -005ml)

- TEMED 0.004ml(0.0032-0.002ml)

3) 2)에서 만든 gel을 각 plate에 약 3ml씩(피펫으로 조심히 내린다)

4) DW를 각 0.5ml씩 bubble이 안 생기도록 주의.그리고 물을 조금 얹어 줘 표면이 고르도록 만들어 준다

5) gel이 굳는 동안 stacking gel (5% ,3ml) 준비

( DW를 제거한 후 TEMED를 직전에 넣을 것)

3ml:2개 (2ml:1)개의경우

조성: - H2O 2.1ml (1.4ml)

- 30% acrylamide mix 0.5ml (0.33ml)

- 1.0M Tris (pH 6.8) 0.38ml (0.253ml)

- 10% SDS 0.03ml (0.02ml)

- 10% ammonium persulfate 0.03ml (0.02ml)

- TEMED 0.003ml (0.002ml)

6) gel이 다 굳은 후 조심해서 DW를 따라냄.

7) 5)에서 만든 gel를 위에 주의하여 넣음 (각 약1.5ml 씩)

8) comb을 끼운 후 굳힘.

9) gel이 다 굳은 후 kit을 옮겨 조립.

10) buffer (SDS running buff.)를 부은 후 lane washing

11) loading (sample 10㎕ + FOZ 2㎕) , 약 80V(3hr), 100V(2hr), 150V(1hr) 로 running

 

 

 

2. After SDS-PAGE

1) Treat the gel with 2.5% Triton X-100 for 20 min

2) Repeat again

3) Wash with water two times for 20min each(물로 washing한는단계에서 시간을 좀 끌어도 상관없다.)

4) React with 100ml of Zymography reaction buffer at 37 ℃, 4-16 hr

5) Staining (about 1hr) and destaining (about 1hr)

6) Dry it ( 80℃ , about 1hr ) or RT에서 하루 정도 말리면 OK

 

 

 

◎zymography reaction buffer

 

5ml 1M Tris (pH7.5)

1ml 1M CaCl2

3ml 5M NaCl

1ml 0.2mM ZnCl2

4ml 25% TX-100

1ml 0.2% NaN3

up to 100ml DW

 

 

◎ FOZ buffer (sample buffer)

4% SDS

20% glycerol

0.01% bromophenolblue

0.125M Tris-Cl ( pH 6.8)

 

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Posted by 가우너


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