Gelatin- zymography (for MMP Analysis)
1. SDS-PAGE containing 1mg/ml gelatin (100mg/ml)
1) gel caster를 깨끗이 washing
2) 10% gel, 10ml 준비 (8ml:2개-5ml:1개)개의경우
조성: - H2O 4 ml(3.2 - 2ml)
- 30% acrylamide mix 3.3ml(2.64-1.65ml)
- 1.5M Tris (pH 8.8) 2.5ml(2 -1.24ml)
- 10% SDS 0.1ml(0.08 -0.05ml)
- 10% ammonium persulfate 0.1ml(0.08 -0.05ml)
- gelatin 0.1ml(0.08 -005ml)
- TEMED 0.004ml(0.0032-0.002ml)
3) 2)에서 만든 gel을 각 plate에 약 3ml씩(피펫으로 조심히 내린다)
4) DW를 각 0.5ml씩 bubble이 안 생기도록 주의.그리고 물을 조금 얹어 줘 표면이 고르도록 만들어 준다
5) gel이 굳는 동안 stacking gel (5% ,3ml) 준비
( DW를 제거한 후 TEMED를 직전에 넣을 것)
3ml:2개 (2ml:1)개의경우
조성: - H2O 2.1ml (1.4ml)
- 30% acrylamide mix 0.5ml (0.33ml)
- 1.0M Tris (pH 6.8) 0.38ml (0.253ml)
- 10% SDS 0.03ml (0.02ml)
- 10% ammonium persulfate 0.03ml (0.02ml)
- TEMED 0.003ml (0.002ml)
6) gel이 다 굳은 후 조심해서 DW를 따라냄.
7) 5)에서 만든 gel를 위에 주의하여 넣음 (각 약1.5ml 씩)
8) comb을 끼운 후 굳힘.
9) gel이 다 굳은 후 kit을 옮겨 조립.
10) buffer (SDS running buff.)를 부은 후 lane washing
11) loading (sample 10㎕ + FOZ 2㎕) , 약 80V(3hr), 100V(2hr), 150V(1hr) 로 running
2. After SDS-PAGE
1) Treat the gel with 2.5% Triton X-100 for 20 min
2) Repeat again
3) Wash with water two times for 20min each(물로 washing한는단계에서 시간을 좀 끌어도 상관없다.)
4) React with 100ml of Zymography reaction buffer at 37 ℃, 4-16 hr
5) Staining (about 1hr) and destaining (about 1hr)
6) Dry it ( 80℃ , about 1hr ) or RT에서 하루 정도 말리면 OK
◎zymography reaction buffer
5ml 1M Tris (pH7.5)
1ml 1M CaCl2
3ml 5M NaCl
1ml 0.2mM ZnCl2
4ml 25% TX-100
1ml 0.2% NaN3
up to 100ml DW
◎ FOZ buffer (sample buffer)
4% SDS
20% glycerol
0.01% bromophenolblue
0.125M Tris-Cl ( pH 6.8)
