Isolation of immune cells from human peripheral blood

 Observation of immune cells

 

 

1. 실험의 목적

blood내에 존재하는 여러종류의 cell들을 각각 분리해보고 각 cell들의 크기, 모양, 내부의 핵과 과립 등을 관찰하여 그들의 기능과 연관시켜 알아본다.

 

2. 실험의 원리

피의 조성은 plasma가 55%로 되어있고 세포들이 45%를 이룬다. 이 세포들에는 면역반응과는 관계가 없지만 산소의 운반에 중요한 역할을 하는 적혈구(red blood cells)와 면역반응에 중요한 역할을 하는 백혈구(white blood cells), 그리고 혈소판으로 나눈다.

백혈구에는 T cells, B cells, & natural killer cells등을 포함하는 lymphocyte가 있고 neutrophils, eosinophils, basophils를 포함하는 granulocyte가 있다.

실험의 원리를 살펴보면 Ficoll/Hypaque와 같은 lymphocyte separation medium(LSM)에서 세포의 밀도차를 이용하여 각각의 세포들을 분리한다. 즉 LSM의 밀도가 1.077로서 blood cells을 LSM위에 얹고 centrifuge하면 이보다 밀도가 작은 lymphocyte와 monocyte는 LSM위에 있게되고, 밀도가 큰 RBC와 granulocyte는 LSM 아래에 가라앉게 된다. 이렇게하여 얻은 lymphocyte와 monocytes는 monocyte의 adherance 성질을 이용하여 분리한다. 또한 RBC와 granulocyte는 hypotonic solution에서 RBC의 용혈(lysis) 현상을 이용하여 분리한다. lymphocyte를 B cell과 T cell로 분리하는 데에 는 여러가지 방법들이 있지만 여기에서는 T cell이 특이적으로 SRBC와 rosetting을 형성하는 능력을 이용한다.

 

 

 

3. 재료 및 방법

Materials

50ml syringe, infusion set, heparin, 70% ethanol, cotton.

blood(human peripheral blood)

HBSS(Hank's balanced salt solution), LSM(lymphocyte separation medium)

centrifuge, Hemacytometer, microscope, cytospin,

pasteur pipette, slide glass

Giemsa's solution or Hematoxyiin & Eosin solution

absolute ethanol, distilled water.

 

Methods

1)haparin을 넣은 infusion set으로 human peripheral blood를 얻는다.

2)cornical tube에 blood와 HBSS를 동량으로 넣어 혼합한다.

3)Ficoll/Hypaque(ρ=1.077) 15ml 위에 2)의 sample을 조심스럽게 얹는다.

4)2000rpm에서 20min간 centrifuge한다.

<MNC의 분리>

5)위의 원심분리 결과 생긴 LSM과 media의 interphase에서 MNCs을 Pasteur pipette 으로

조심스럽게 회수한다.

6)HBSS로 3번 정도 washing을 한다 (2000rpm,5min)

7)Hemacytometer로 cell counting을 하여 적절한 세포숫자를 맟춘다.

8)450rpm에서 5min동안 cytospin으로 sample을 slide glass위에 정착시킨다.

9)적절한 staining을 하여 관찰한다.

<granulocyte의 분리>

10)위의 원심분리 결과 tube밑에 가라앉은 precipition(RBC+granulocyte)에 소량의 멸균된 증류수를

1min 이하로 처리한다.

11)과량의 HBSS를 첨가하여 증류수를 희석한다.

12)2000rpm에서 5min동안 원심분리 하면 RBC는 파괴되고 granulocytes만 tube바닥에 가라앉는다.

13)다음 step은 7)-9)와 동일하다.

<Giemsa's staining>

a)slide glass위에 methanol을 떨어트려 sample을 고정시킨다.

b)Giemsa's solution으로 5min-10min동안 염색한다.

c)tap water로 washing한다.

d)air dry & observation.

<Hematoxylin & Eosin staining>

a)fixation

b)Hematoxylin solution으로약 5min동안 염색한다.

c)95% ethanol로 2min동안 탈색한다.

d)tap water로 washing한다.

e)Eosin solution으로 5min-10min동안 대조염색을한다.

f)washing

g)air dry & observation

 

4. 예상되는 결과

T cell과 B cell을 포함하는 lymphocytes와 monocytes(macrophage)를 한개의 slide glass에서 동시에 관찰할 수 있을 것이다. 이때 lymphocyte는 직경이 6-8μm로서 직경이 9-12μm인 monocyte보다 작다. 또한 세포 모양과 핵모양에서 크게 차이가 난다. 즉 lymphocyte는 세포 모양이 거의 구형에 가깝고 핵이 둥굴며 세포의 거의 대부분을 차지한다. 반면에 monocyte는 아메바 모양을 하고 있으며 핵이 말발굽 모양으로 보인다. 핵과 세포질의 color는 염색액의 종류에 따라 달라진다. granulocytes도 한개의 slide위에서 동시에 관찰이 가능하다. 이들은 주로 핵모양으로 구분이 가능하다. 즉 neutrophil은 핵이 많이 분절(segemented)되어 있고, eosinophil은 핵이 2개 정도로 분절되어 보인다. 특히 Eosin으로 염색했을때 eosinophil의 granules의 성질에 의해 과립들이 특히 붉은색으로 염색된다. basophile은 적은 빈도로 존재하기 때문에 관찰하기가 어렵다. 또한 핵이 거의 보이지 않고 granules만 보이기 때문에 따로 과립염색을 하여야 관찰이 용이하다. 이외에도 아직 분화 단계에 있는

백혈구들도 핵모양과 형태에 따라서 관찰된다.

 

5. 고찰

1) 실험수행상의 주의할점

혈액을 얻을때 응고되지 않도록 주의한다.

Ficoll/Hypaque위에 sample을 중첩시킬때 흔들려서 LSM아래로 내려가지 않도록 주의한다.

원심분리후 sample이 들어있는 tube를 조심스럽게 다루고, MNC을 회수할때는 LSM이 같이 회수되지 않도록 주의한다.

RBC를 파괴할때 granulacyte가 파괴되지 않도록 증류수 처리시간을 되도록 짧게 한다. 만약 증류수만 처리하는 것이 세포에 해로울경우 0.83% ammonium chloride in 10mM & 20mM HERPES buffer를이용할수 있다.

slide glass위에 세포수가 너무 많으면 서로 겹쳐서 정확한 관찰이 어려우므로 cytospin을 돌릴때 104-105cells/ml 정도가 적당하다.

2) 실수하기 쉬운 함정

염색시에는 유효기간을 지나지 않은 염색액을 사용해야하며, 염색액은 항상 염색전에 여과하여야만 깨끗한 염색을 기대할수 있다. 정해진 시간내에 염색이 잘 되지않으면 염색시간을 충분히 준다.

3) 기타 참고할 사항

[Cell counts with a Hemacytometer]

백혈구나 적혈구를 셀때 주로 Hemacytometer chamber(fig)를 이용한다. 그림에서 1-4로 표시된 큰 사각형으로 된 구역은 주로 백혈구를 셀때 이용하고 5의 구역은 적혈구를 셀때 이용한다. 각 구역의 가로와 세로는 각각 1mm이고 높이는 0.1mm이므로 들어있는 세포의 양은 10-4이다. 즉 한구역에 들어있는 세포의 숫자에 104을 곱한것이 ml당 세포수가 된다. 이때 여러 종류의 실수에 의하여 정확한 세포수의 계산이 어려워지는데 다음과 같은것들이 있다. 부정확한 희석, pipetting동안 세포의 손실, 세포의 고르지못한 혼탁, chamber에 세포를 너무 많거나 적게 넣은 경우, 세포가 완전히 가라앉기전에 숫자를 센 경우등이 있다. 특히 chamber내에 세포의 고르지못한 분포로 인하여 정확한 계수가 안되는 경우가 있는데 이때는 여러구역을 세어서 나누어 계산함으로서 오차를 줄일수있다. 전체 백혈구수를 셀때는 먼저 적혈구를 용혈시켜 제거해야 작은 백혈구와 적혈구의 혼동이없이 정확한 백혈구수를 셀수있다.

 

* 재료 및 방법

[Materials]

Cell suspension, Hemacytometer & coverslip, Microscope, Pasteur pipettes & rubber bulb, Hand counters. counting solution: 3% acetic acid in water(v/v) 또는 0.01% gentian violet in 3%acetic acid(Turk's solution)

 

[Methods]

1. 세포수를 세기전에 counting solution이나 원래의 배양액으로 적절하게 희석한다. 이때 적절한 농도는 5-10x105 cells/ml(50-100 cells per large square)이다.

2. Pasteur pipette을 이용하여 세포 현탁액을 cover slip아래에 loading하는데 이때 주의해야 할것은 너무많이 loading되어 세포 현탁액이 grid를 지나 overflow well까지 가지않도록 해야한다. 만약 너무많이 loading되었으면 깨끗이 닦아내고 다시 loading하여야 한다. loading후 세포가 가라않도록 잠시 기다린다.

3. 백혈구를 셀때는 1-4까지의 네구역을 세어서 다시 4로 나누어 계산한다.적혈구는 백혈구보다 크기가 작으므로 작은 사각형으로 이루어진 제 5구역 중에 4군데의 corner의 사각형과 중심의 한 사각형의 세포수를 세어 계산한다. 어떤 세포들은 경계선에 걸쳐있는데 이 경우에는 4개중 2개의 경계선에 걸친 세포들만 유효한 세포로 세어서 계산한다. 정확한 백혈구수를 계산하고자 할때는 최소한 200개 이상의 세포를 세어야한다.

4. 환산된 세포수는 다음의 공식으로 얻을 수 있다.

백혈구: cells/ml=각 사각형의 평균숫자 x 104/ml x 1/희석배수

적혈구: cells/ml= 작은 사각형 5개의 세포수 x 5 x 104/ml x 1/희석배수

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Posted by 가우너

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