RNA extraction

 RNA preparation - harvest

 

 

 

 

 

RNA extraction

 

 RNA는 실험 기법으로 많이 사용된다. protein레벨 말고 더 아래의 단계인 RNA에서 확인할 수 있는 것이 많이 있기 때문이다. 또한 shRNA나 siRNA를 이용한 세포내 유전자 변형을 이용하여 특정 protein의 발현을 조절하는 실험 기법도 사용할 수 있다. 꼭 필요한 실험 방법중의 하나이다.
RNA는 매우 불안정하기 때문에 항상 주위를 청결하게 하고 tip은 꼭 멸균이 된 것을 사용하여야 한다.

 

 

 

Material & Method
1. TRIzol Reagent (Trisol solution, TRI reagent)
2. DEPC (RNase free) water or 0.5% SDS solution in DEPC treated water.
3. Chloroform (Fisher)
4. Isopropyl alcohol (2-Propanol) (Fisher)
5. 75% Etanol (in DEPC treated water)
6. Steril or RNase treated pipette tips, microcentrifuge tubes, pestles or motorized homogenizer
7. Microcentrifuge

꼭 말해주고 싶은 것은 내가 뽑는 방법은 fix된것이  아니라는 것이다.
나는 purity를 높이기 위해 보통 washing이 좀 많이들어 가는 편이다.
만약 RNA가 거의 안나온다면 purity보다는 양을 먼저 생각해야 된다면 washing을 좀 빼도 된다.

 

1. cell을 RNase free상태의 1.5ml microtube에 넣고 centrifuge하자.

  1x10^6 정도의 세포를 harvest 해서 centrifuge 후 -20도 냉장고에 넣어놓은 것을 사용해도 된다.
2. supernatant 제거하고 TRIzol(easy blue:국산) 을 1 ml 첨가한다.
3. 잘 pipetting해서 풀어주고 3~5분 반응 (아이스박스)
4. chloroform 200ul 첨가 후 3~5분 반응 (아이스박스)

5. 13000 g 에 10분동안 spin (4C)
6. 상등액을 200ul 를 새 tube에 옮겨준다.
7. isopropanol (isopropyl alcohol)을 500ul 넣어주다.
8. 상온에서 10분간 반응 시켜준다. (튜브의 액상이 흐려지면 RNA가 많은 것이다.)

9. 13000g 에 10분 동안 spin (4C)
10. tube 바닦에서 pellet 형태의 RNA를 볼수 있으며 1 ml의 75% EtOH 첨가한다.
11. washing 개념으로 voltexing 하면 안된다.

12. 12000g 에 5분 동안 spin (4C)

13. pellet를 공기중 또는 티슈로 말려준다. 5~10분 정도 말려주는데 이때 완전히 말리지 않고 약간의 물기가 있도록 말려준다.

14. 30~60 ul의 DEPC-DW로 잘 녹여준다. 보통 나는 35 ul로 녹인다.
15. Determination of Concentration and purity

a. 35 ul에서 5ul를 따서 995ul의 RNA free DW (DEPC-DW) 에 넣어준다.
995RNA free DW + 5 RNA
b. blank는 DEPC-DW로 잡아주고 260 nm와 280 nm에서 측정한다.
c. RNA농도는 요즘 기계는 보통 계산이 되어 나오지만 기본 공식을 언급하자면

RNA ug/ml = A260 X 33 X dilution factor / 1000
d. purity는 260/280으로 측정가능한데 이 값이 1.7에서 2.0 사이가 나와야 적당하다.

 

 

 

 

 

RNA를 뽑고 나면 보통 바로 RT (cDNA) 를 합성한다. RNA는 불안정하기 때문에 분해되기 쉽기 때문이다.
그래서 RNA 보다 안정한 cDNA를 바로 만든다. cDNA를 만드는 방법은 각각 실험실 마다 조금은 다른 걸로 알고 있다.